中文名称:DENV2 EDEN3295腹腔途径感染C57BL/6小鼠模型
英文名称:DENV2 EDEN3295 intraperitonealy infection C57BL/6 mouse model
类型:登革热动物模型
分级:NA
用途:用于登革热相关研究
研制单位:杜克-新加坡国立大学医学院
保存单位:杜克-新加坡国立大学医学院
来源文献:Proteasome Inhibition Suppresses Dengue Virus Egress in Antibody Dependent Infection.
PMID:26565697
DOI:10.1371/journal.pntd.0004058
1. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的临床表现
为确定NGC株与N10株对小鼠致病性的差别,分别使用NGC株与N10株感染4~6周Ifnar1-/-小鼠,监测小鼠体重变化、疾病症状、致死情况等临床表现。结果显示:两株病毒感染小鼠的体重都在Dpi.2开始下降,Dpi.8 NGC感染组小鼠体重为原始体重的98.8%,而N10感染组小鼠体重为原始体重的79.2%(见图1A)。疾病症状方面,NGC感染组小鼠在Dpi.7出现侧瘫等神经症状;N10株感染小鼠在Dpi.4产生竖毛、虚弱等表现,Dpi.5产生弓背,Dpi.8发生死亡(见图1B、1C),两组具有统计学差异(P<0.01)。结果表明:与NGC株感染小鼠相比,N10株感染小鼠体重下降幅度较大,疾病症状明显,死亡率较高,提示N10株对小鼠的致病性高于NGC株。
图1 DENV感染小鼠体重变化情况及临床表现
Figure 1 Bodyweight changes and clinical manifestations of DENV-infected mice
2. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的病毒载量
为确定NGC株与N10株在小鼠体内复制水平的差异,在小鼠分别感染两株DENV后第2、4、6天收集组织(肠、脾脏、肝脏、肾、脑)和血清样本,使用实时荧光定量PCR方法进行病毒载量的检测。结果显示:小鼠血清中,N10感染组在Dpi.6仍可检测到病毒载量,且显著高于NGC株(见图2A)。与其他组织比较,小鼠脾脏中病毒核酸拷贝水平较高,在Dpi.2两组小鼠脾组织病毒载量差异具有统计学意义(见图2B)。在肾脏和肠组织中,NGC株感染的小鼠仅在Dpi.4检测到病毒载量,而N10株感染的小鼠均可检测到病毒载量(见图2C和2D)。在肝脏中,NGC感染的小鼠并未检测到病毒核酸,而N10株感染小鼠在Dpi.2和Dpi.4均检测到病毒核酸,且在Dpi.4有较高的病毒核酸拷贝数(见图2E)。脑组织中,N10株感染小鼠病毒核酸水平高于NGC株感染小鼠。表明N10株在小鼠体内的分布范围明显高于NGC株,维持时间也明显高于NGC株,说明其更能适应小鼠机体。
图2 DENV感染小鼠病毒载量水平
Figure 2 Viralload levels of DENV-infected mice
3. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的血常规情况
血小板下降和白细胞下降是人类感染登革热的标志性特征之一,为确定NGC株与N10株对小鼠体内血小板和白细胞水平影响的差异,使用血细胞分析仪进行血常规检查。结果显示:在Dpi.2,与NGC组小鼠相比,N10组小鼠的血小板、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数均显著降低,具有统计学意义(见图3A-D)。而血细胞比容未见明显差异(见图3E)。N10组小鼠在Dpi.2,红细胞水平高于NGC组。与NGC株感染小鼠相比,N10株感染的小鼠,血小板、白细胞下降水平更显著,说明N10株比NGC株对Ifnar1-/-小鼠的致病力强。
图3 DENV感染小鼠血细胞计数
Figure 3Complete blood count of DENV-infected mice
4. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的病理学变化
为比较两株DENV对Ifnar1-/-小鼠病理表现的差异,大体解剖发现,肝组织表面有大量坏死灶。将小鼠组织用10%福尔马林固定,苏木精伊红染色(HE染色),进行详细分析。首先,与正常未感染小鼠相比,NGC组所有小鼠脑组织切片在Dpi.6开始观察到脑干、小脑出血、炎性细胞浸润等病理表现。仅有25%的N10组小鼠在Dpi.6出现脑干出血、大脑脑膜血管扩张充血,炎细胞浸润等病理表现。表明N10株相对于NGC株对小鼠的神经毒力下降。其次,在Dpi.6,两组小鼠肾脏中均产生肾小管上皮细胞水肿、空泡变性的病理表现。两组小鼠肠组织内均未见明显病理变化。脾脏组织中,Dpi.2,NGC组小鼠未见明显病理变化,N10组小鼠脾脏有出血,灶性坏死的病理表现。Dpi.4,两组小鼠均有红髓细胞增生的病理表现。Dpi.6,NGC组小鼠髓外造血,N10组小鼠脾脏结构不清晰,红髓大量细胞增生(见图4B)。肝脏组织中,Dpi.2,NGC组小鼠有轻度肝细胞水肿;N10组小鼠表现为灶性凝固性坏死。Dpi.4,NGC组小鼠肝细胞灶性凝固性坏死伴有炎细胞浸润,N10组小鼠产生肝细胞空泡变性和灶性坏死的病理表现。Dpi.6,NGC组小鼠表现为空泡变性,小灶性炎细胞浸润。N10组小鼠表现为灶性坏死和炎细胞浸润(见图4A)。表明:N10株感染小鼠后,病理表现发生了变化,与人类重症登革病理表现趋同。
图4 DENV感染小鼠组织病理学变化
Figure 4Histopathological changes in DENV-infected mice
注:以上均为HE染色结果(100X)
5. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的细胞因子
在重症登革患者观察到细胞因子水平的改变。为比较NGC株与N10株DENV对小鼠细胞因子表达的影响,收集DENV感染后的小鼠血浆,通过Luminex检测多种细胞因子。结果发现,N10组小鼠血浆内的IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎症因子水平在Dpi.2显著高于NGC组。Dpi.4,N10组TNF-α急剧增加,高于NGC组,表明Th1细胞介导的炎症反应增强。据报道IL-6和TNF-α水平升高与重症登革相关,因此N10株感染小鼠模型疾病严重程度增加。在Dpi.2,N10组的 IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-22水平均高于NGC组。在感染后的前四天,IL-13、IL-18、IL-22等细胞因子水平逐渐升高。但N10组的IL-2水平低于NGC组。由于Th2细胞分泌的IL-5、IL-6、IL-13等因子主要参与B细胞增殖、分化和抗体产生,因而IL13等因子水平增加,提示与疾病严重程度相关。趋化因子:MIP-α、RANTES、MCP-3等细胞因子水平在感染前四天也呈上升趋势,N10组的表达量高于NGC组。表明:IL-6、IFN-γ、IL-13、IL-22等细胞因子水平升高,可能介导重症登革热的产生。
图5 DENV感染小鼠细胞因子表达水平
Figure 5Cytokine expression levels in DENV-infected mice